Курсовая работа: Специфичность фермента амилазы
Некоторые аналоги витамина
В6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипиридоксин и аминоптерин,
действуют как конкурентные, так называемые коферментные, ингибиторы (или
антивитамины), тормозящие многие интенсивно протекающие при патологии
биологические процессы в организме. Применение подобных аналогов в медицинской
практике (в частности, в дерматологии и онкологии) основано на конкурентном
вытеснении коферментов из субстрат связывающих центров ключевых ферментов
обмена.
Неконкурентное
ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами
и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента.
Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора
на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной
связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение
становится необратимым. Примером необратимого ингибирования является действие
йодацетата, ДФФ, а также диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты.
Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов
металлов и молекуле фермента.
Следует указать, что
неконкурентное ингибирование также может быть обратимым и необратимым,
поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибитором за активный
центр. Примеры необратимого ингибирования приведены ранее. При обратимом
неконкурентном ингибировании субстрат S и ингибитор I связываются с разными
центрами, поэтому появляется возможность образования как комплекса EI, так и
тройного комплекса EIS; последний может распадаться с освобождением продукта,
но с меньшей скоростью, чем комплекс ES.
Этот тип неконкурентного
ингибирования чаще всего наблюдается у ферментов, катализирующих превращения
более одного субстрата, когда связывание ингибитора не блокирует связывание субстрата
с активным центром. Ингибитор при этом соединяется как со свободным ферментом,
так и с ES-комплексом.
Известно, кроме того, так
называемое бесконкурентное ингибирование, когда ингибитор связывается с ферментом
также в некаталитическом центре, однако не со свободным ферментом, а только с
ES-комплексом в виде тройного комплекса.
Для выяснения вопроса о
типе ингибирования пользуются уравнениями Михаэлиса-Ментен, Лайнуивера-Бэрка
или другими, например уравнением Эди-Хофсти:
ν = -Km(y/[S]) + Vmax
и соответствующими
графиками в прямолинейных координатах.
Рис. 2. Графики зависимости скорости
ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии конкурентного ингибитора.
а - в координатах v от [
S ] ; б - в координатах 1/v от 1 / [ S ] ; Vmaxи Vi -
максимальные скорости реакции; Кm и Kmi - константа
Михаэлиса соответственно в отсутствие (1) и в присутствии (2) ингибитора.
Рис. 3. Графики зависимости скорости
ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии неконкурентного ингибитора.
При конкурентном типе
ингибирования ингибитор увеличивает значение Кm, не оказывая влияния
на максимальную скорость Vmax. Это означает, что при достаточно
высокой концентрации субстрата [ S ] ингибитор вытесняется молекулами субстрата
из комплекса EI. При неконкурентном ингибировании (рис. 4.22) ингибитор снижает
величину максимальной скорости. Если при этом величина Кm не
уменьшается, то говорят о полностью неконкурентном ингибировании. Подобный тип
ингибирования имеет место при образовании неактивных, труднодиссоциирующих
комплексов EI и (или) EIS. Часто, однако, наблюдается смешанный тип
ингибирования, иногда называемый частично неконкурентным, или обратимым
неконкурентным ингибированием (см. ранее), при котором снижение Vmax сочетается
с одновременным увеличением значений Кm. Это означает, что комплекс
EI сохраняет частичную активность, т.е. способность к образованию
промежуточного тройного комплекса EIS, в котором субстрат подвергается
замедленному каталитическому превращению. В редких случаях степень торможения активности
фермента может увеличиваться с повышением концентрации субстрата. Для этого
типа торможения был предложен, как отмечено ранее, довольно неточный термин
«бесконкурентное ингибирование». Один из механизмов такого торможения
обусловлен возможностью соединения ингибитора с комплексом ES с образованием
неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса EIS.
2. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ
ЧАСТЬ
Исследование воздействия внешних факторов на амилазу слюны 1. Специфичность амилазы слюны Методика приготовления разбавленной слюны: Прополоскать рот два раза дистиллированной водой для удаления остатков пищи. Взять в рот 20 мл. дистиллированной воды, держать её во рту около двух минут. полученную жидкость слить в стакан или колбу. Жидкость представляет собой раствор слюны, содержащий амилазу-фермент. Ход работы: В 2 пробирки добавить по 20 капель раствора крахмала, в 3-ю- 20 капель раствора сахарозы. В первую пробирку налить 10 капель дистиллированной воды, во вторую и в третью пробирки добавить по 10 капель разведенной слюны. Содержимое пробирок перемешать встряхиванием и поместить пробирки в водяную баню с температурой 37-40’ С. Через пять минут пробы разделить пополам и проделать реакции с йодом (для чего добавить в каждую пробирку по 1 капле раствора йода в йодистом калии) и с фелинговой жидкостью (добавить по 5 капель фелинговой жидкости). Результаты отражены в таблице 1 Таблица 1
№ пробирки |
Субстрат |
фермент |
Реакция с йодом |
Реакция с Фелинговой жидкостью |
До |
После |
1 |
крахмал |
|
бесцветный. |
Сине-фиолетовое окрашивание (со временем исчезает) |
- |
2 |
крахмал |
амилаза |
|
Бесцветный |
- |
3 |
сахароза |
амилаза |
бесцветный |
Голубой оттенок (со временем не исчезает) |
- |
Реакция гидролиза крахмала на субстрате с участием фермента амилаза прошла, о чем свидетельствует положительная проба с Фелинговой жидкостью, и отрицательная с реактивом Люголя. Амилаза катализирует гидролиз крахмала, сахароза не катализирует гидролиз крахмала. Реакция гидролиза крахмала с участием амилазы
Обнаружение продуктов
гидролиза крахмала
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5 |