Реферат: Легко- и трудногидролизуемые полисахариды
В гидролизатах происходит мутаротация моносахаридов, т.е. образование
равновесной смеси таутомерных форм: б-, в-пиранозных, б-, в-фуранозных и открытой. Для глюкозы это иллюстрирует
следующая схема:
Существование таутомерных форм затрудняет определение
состава моносахаридов в гидролизате.
Моносахариды нелетучи и непосредственное разделение их
смесей методом газожидкостной хроматографии невозможно. Сахара могут быть
хроматографически разделены в виде летучих производных - простых и сложных
эфиров. Широко распространен метод анализа в виде триметилсилильных производных
моносахаридов. Последние являются летучими гликозидами простых
О-триметилсилиловых эфиров углеводов, образующихся в результате полного
замещения гидроксильных групп моносахаридов при их силировании.
В качестве силирующего реагента моносахаридов используют
смесь триметилхлорсилана и гексаметилдисилазана в среде пиридина.
В качестве примера приводится схема реакции силирования для
галактозы
Подобным образом синтезируются TMС-производные
других моносахаридов. При этом устанавливается новая равновесная смесь, в
которой преобладают пиранозные формы. Соотношение таутомеров в зависимости от
условий колеблется. Состав ТМС-производных таутомерных форм индивидуальных
моносахаридов приведен ниже.
Для уменьшения числа пиков на хроматограмме и упрощения ее
обработки моносахариды восстанавливают до соответствующих многоатомных спиртов с
последующим их превращением в ацетаты. Каждый полиол дает на хроматограмме один
пик, поскольку таутомерия у полиолов невозможна.
При анализе ТМС-производных методом газожидкостной
хроматографии инертный газ служит подвижной фазой, неподвижной фазой является
жидкость, нанесенная тонким слоем на твердый носитель. В качестве жидкой фазы
используют различные силиконовые масла и полиэфиры. Наиболее селективными
фазами из вырабатываемых отечественной промышленностью являются неполярное
метилхлорсиликоновое масло и полярный политриэтиленгликольсебацинат. В качестве
твердого носителя применяют адсорбенты порохром-3 или хромат N.
Для хроматографического разделения смеси летучих производных
моносахаридов используют газовые хроматографы, состоящие из колонки с
термостатом, в которой происходит разделение смеси, пламенно-ионизационного
детектора, дающего сигнал прямо пропорциональный количеству анализируемого
вещества, блоков управления и самопишущего прибора. Выход ТМС-производных,
регистрирующийся самопишущим прибором в виде пика на диаграммной ленте,
соответствует времени удерживания tR - времени,
прошедшего с момента введения пробы в колонку до момента появления компонента
смеси в детекторе.
В соответствии с tR на
хроматограмме в определенном порядке появляются пики индивидуальных соединений.
Xpoматограмма - совокупность пиков, соответствующая
порядку выхода и массе индивидуальных компонентов смеси. Порядок выхода при
хроматографическом разделении ТМС-производных зависит от жидкой фазы. Его
устанавливают предварительно для данной фазы с использованием модельных
ТМС-производных чистых моносахаридов по их времени удерживания. На рис. приведена
в качестве примера хроматограмма модельной смеси, разделенной на колонке с
метилхлорфенил-силиконовым маслом в качестве жидкой фазы.
Существует несколько методов количественного определения
состава смеси по полученным хроматограммам. По первому методу определяют
площади пиков всех таутомеров каждого моносахарида расчетом площади треугольной
аппроксимацией пика - умножением основания пика на половину высоты. При
частичном наложении пиков друг на друга и невозможности прямого измерения
основания площадь пика определяют умножением его высоты на ширину, измеренную
на половине высоты. Возможно также определять долю каждого пика его переносом
на бумагу и взвешиванием вырезанного из нее пика на аналитических весах, относя
найденную массу к массе всех анализируемых пиков. Результат выражают в
процентах, используя метод нормировки площадей.
Хроматограмма модельной смеси TMC
производных моносахаридов
По второму методу количественное определение массовой доли
конкретного моносахарида в смеси производят по площади пика одного из его
таутомеров, исходя из условия, что при синтезе ТМС-производных в строго
постоянных условиях соотношение таутомеров сохраняется постоянным. Это
позволяет для расчета выбрать наиболее разрешенный пик, называемый
характеристическим. В качестве таких пиков обычно используют пики
ТМС-производных в-Ж,-арабинопиранозы, в-П-кси-лопиранозы,
a-D-маннопиранозы, a-D-галактопиранозы и в-D-глюкопиранозы. Площади пиков остальных таутомеров
непосредственно не измеряют, а находят расчетом. С учетом доли характеристического
пика вычисляют общую площадь пиков всех таутомеров данного моносахарида. Количественное
соотношение таутомерных форм необходимо устанавливать для данных условий
хроматографирования и при. их изменении определение следует проводить вновь. Долю
конкретного моносахарида находят отнесением площади всех пиков данного
моносахарида к общей площади всех пиков.
Количественное определение массы индивидуальных
моносахаридов производят с использованием внутреннего стандарта. Масса сорбита,
добавляемая в анализируемую смесь, должна обеспечить его концентрацию в
растворе, примерно соответствующую концентрации индивидуальных моносахаридов. Расчет
ведут по градуировочному графику. График получают, по данным
хроматографирования эталонных растворов, содержащих индивидуальный моносахарид
и сорбит. Градуировочный график строят в координатах: по оси абсцисс - масса
чистого моносахарида в эталонном растворе, по оси ординат - отношение площади
характеристического пика этого же моносахарида к площади пика внутреннего стандарта.
График имеет линейную форму. Прямую линию проводят с использованием метода
наименьших квадратов.
Относительная ошибка определений Сахаров в гидролизате
зависит от их массовой доли в жализируемой смеси и составляет 1...5%. Общее
время анализа при серийном проведении определений около 2 ч, не считая времени
на получение градуировочных графиков.
Методика анализа. Анализ гидролизатов методом газожидкостной
хроматографии включает подготовку гидролизатов к анализу, синтез
ТМС-производных моносахаридов, хроматографическое разделение этих производных и
обработку хроматограмм.
Подготовка гидролизатов к анализу. Гидролизаты, полученные
при обработке древесины концентрированной серной кислотой, нейтрализуют
карбонатом бария до рН 5. Раствор отфильтровывают через конусообразную
стеклянную воронку с бумажным фильтром от осадка сульфата бария. Гидролизаты,
полученные при обработке древесины соляной кислотой, нейтрализуют карбонатом
натрия до рН 5. В полученных гидролизатах определяют массовую долю PB. При необходимости гидролизат упаривают в вакуум-сушильном
шкафу при температуре 40°С.
Синтез ТМС-производных моносахаридов. В круглодонную колбу
вместимостью 50 см3 вносят пипеткой пробу нейтрализованного и
упаренного гидролизата, содержащего около 20 мг PB.
Работу выполняют в двух вариантах - с внутренним стандартом или
без него.
Раствор сорбита вносят в колбу пипеткой в объеме,
соответствующем его массе, равной 2...5 мг. Колбу присоединяют к ротационному
вакуумному испарителю и выпаривают раствор при температуре 40...42°С и
остаточном давлении 0,5...1 кПа. Выпаривание производят досуха. Для удаления
следов воды к упаренной пробе добавляют 2...3 раза по 1 см3
спиртотолуольной смеси, которую также удаляют упариванием. Затем сухой остаток
в этой же колбе растворяют в 2 см3 свежеперегнанного сухого
пиридина, добавляют 0,6 см3 гексаметилдисилазана и 0,3 см3
триметилхлорсилана. Колбу закрывают пробкой, энергично встряхивают 30 с и при
комнатной температуре выдерживают реакционную смесь в течение 10 мин.
Если анализируемая проба плохо растворяется, колбу нагревают
на водяной бане при температуре 75...85°С в течение 2...3 мин. Затем проводят
упаривание пиридина из реакционной смеси на ротационном испарителе при
температуре 40°С и остаточном давлении 0,5...1 кПа в течение 10 мин. Остаток
растворяют в этой же колбе в 2 см3 "-гексана. В хорошо закрытых
колбах ТМС-производные устойчивы в течение нескольких недель.
Массовую долю каждого моносахарида в гидролизате, %,
рассчитывают по формуле
где т, - масса моносахарида в пробе гидролизата, мг; х - объем пробы гидролизата, см3.
По полученным значениям с, Для гидролизатов легко - и
трудногидролизуемых полисахаридов рассчитывают массовые доли соответствующих
полисахаридов в процентах по отношению к абсолютно сухой древесине.
По второму варианту рассчитывают долю каждого моносахарида в
процентах от их обшей массы по методу нормировки площадей. Вычисляют сумму
площадей всех пиков S и площади пиков каждого
моносахарида S4.
Массовую долю каждого моносахарида, % к их общей массе,
рассчитывают по формуле
Определение времени удерживания моносахаридов и
построение градуировочных графиков. По первому варианту анализа готовят
эталонные растворы определенной концентрации чистых моносахаридов и внутреннего
стандарта - сорбита. Для каждого моносахарида готовят пять эталонных растворов
концентрацией от 2 до 10 мг/см3. Концентрация раствора сорбита
постоянна - 4 мг/см3. Из каждого раствора отбирают три пробы,
синтезируют TMC-производные и хроматографируют, как
указано выше. На каждой из трех хроматограмм для каждого пика фиксируют
значение tR, вычисляют площадь
характеристического пика таутомера моносахарида S1
и площадь пика сорбита Scl. Таким образом
находят S,/Scr для
всех пяти эталонных растворов. По средним значениям результатов трех
параллельных анализов для каждого из пяти эталонных растворов строят графики
зависимости отношений SJScr от массы
моносахаридов, пользуясь методом наименьших квадратов.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5 |
